目 录
绪论
本教程基因工程实验流程图
实验一 碱法抽提质粒DNA
一 实验目的
二 实验原理
（一）克隆载体pUC118质粒与宿主菌MV1184
1pUC118质粒结构
2MV1184宿主菌F＇因子基因型
3MV1184宿主菌染色体基因型
（二）质粒DNA的抽提
1裂解细胞
2分离
3纯化
（三）碱法抽提的主要试剂
（四）抽提产量与试剂用量的估算
1抽提产量估算
2试剂用量估算
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验二 电泳法测定DNA的浓度与纯度
一 实验目的
二 实验原理
（一）琼脂糖凝胶
（二）电泳时DNA迁移的影响因素
1DNA分子质量的影响
2DNA构型的影响
3胶浓度的影响
4电场强度的影响
5溴乙锭的影响
6电泳缓冲液的影响
7碱基组成与电泳温度的影响
（三）电泳缓冲液
1TAE
2TBE
3TPE
（四）上样液
（五）上样量的控制
（六）DNA电泳条带的检测
（七）电泳的分子质量梯度标志
1线状分子质量梯度标志
2超螺旋分子质量梯度标志
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验三 载体与供体DNA的酶切
一 实验目的
二 实验原理
（一）限制性内切酶的一般性质
1一般限制酶的识别位点
2识别超长碱基序列的酶
3各类粘性末端的特点
4同识别序列的酶
5酶切反应中的位点优先现象
6DNA构型对酶切的影响
7近末端切割
8酶的星号反应
9大肠杆菌中甲基化现象对酶切的影响
10能切割单链的限制酶
（二）限制性内切酶的使用
1制作基因图谱
2克隆基因
3制备探针
（三）酶切方式
1部分酶切
2完全酶切
（四）酶的质量鉴定
（五）酶的保存
（六）酶单位的定义
（七）限制酶的作用条件
1作用温度
2缓冲体系
3反应时间
4DNA的纯度与浓度
（八）终止酶反应的方法
（九）酶切失败的原因及处理的方法
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验四 目的基因片段的回收
一 实验目的
二 实验原理
（一）各类回收方法
1电泳回收法
2收集孔电泳回收法
3机械破碎凝胶回收法
4溶（熔）胶回收法
5琼脂糖酶降解凝胶回收法
（二）回收方法的选择与操作注意事项
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验五 载体与供体DNA的连接
一 实验目的
二 实验原理
（一）早期的连接理论
（二）近期的计算机模拟反应进程
（三）连接酶
（四）连接反应的影响因素
1连接缓冲液的影响
2pH值的影响
3ATP浓度的影响
4连接温度与时间的影响
5酶浓度的影响
6DNA浓度的影响
7DNA序列的影响
8其他抑制因素的影响
（五）三种连接酶单位定义
1Weiss单位
2d（A―T）环化单位
3粘性末端单位
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验六 CaCl2法转化大肠杆菌
一 实验目的
二 实验原理
（一）各种转化方法与转化率的衡量指标
（二）转化率的影响因素
1试剂（包括水）纯度与器皿清洁程度的影响
2接种前菌种保存方式的影响
3宿主菌生长时期的影响
4CaCl2法0℃放置时间的影响
5化合物与无机离子的影响
6质粒大小、构型与复制起点的影响
7竞争DNA的影响
8共转化质粒的影响
9质粒DNA与转化细胞比例的影响
10菌株基因型recA＋与recA 的影响
11连接缓冲液的影响
（三）大肠杆菌中的限制系统与限制修饰系统
1Mcr限制系统
2Mrr限制系统
3hsd限制修饰系统
（四）宿主菌的选择
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验七 酚/氯仿法快速鉴定转化子
一 实验目的
二 实验原理
（一）DNA水平检测
1快速抽提电泳分析
2快速抽提酶切分析
3原位杂交法
4斑点杂交法
5Southern杂交法
6DNA序列分析
（二）mRNA水平检测
1R环电子显微镜法检测
2杂交抑制翻译
3杂交选择翻译
（三）蛋白质水平检测
1沉淀免疫检测法
2其他免疫检测法
（四）功能水平检测
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验八 随机引物法标记DNA探针
一 实验目的
二 实验原理
（一）酶法标记于链上
1缺口转移法
2随机引物法
3PCR法
（二）酶法标记于末端
13′末端标记法
25＇末端标记法
（三）化学法标记于链上
1直接标记法
2介导标记法
（四）化学法标记于末端
1合成时引入氨基或巯基
2合成后引入氨基或巯基
（五）光化学法标记于链上
1芳香叠氮化合物
2呋喃香豆素衍生物
（六）人工合成于链上
1掺入碱基类似物
2掺入核糖类似物
（七）检测酶直接标记法
1检测酶直接标记于链上
2检测酶直接标记于末端
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验九 菌落原位吸印
一 实验目的
二 实验原理
（一）各类吸印膜
1硝酸纤维素膜（NC膜）
2叠氮氧苄甲基纤维素纸（DBM纸），重氮苯硫醚
纤维素纸（DPT纸）和氨基苯硫醚纤维素纸（APT
纸）
3二乙氨基乙基纤维素纸（DEAE纸）
4ECTELA纸
5尼龙膜
6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）
7其他膜
（二）各种转移方法
1毛细管转移法
2真空转移法
3电转移法
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验十 DNA分子杂交
一 实验目的
二 实验原理
（一）DNA的复性与杂交反应动力学方程式
1双链DNA的复性过程
2单链探针的杂交过程
3双链探针的杂交过程
（二）杂交速率的影响因素
1探针分子复杂性的影响
2探针分子浓度的影响
3杂交温度的影响
4杂交液pH值的影响
5杂交液中离子强度的影响
6杂交液中甲酰胺浓度的影响
7杂交促进剂的影响
（三）杂交反应的两种模式
（四）杂交分子稳定性的影响
1杂交液中Na＋离子浓度的影响
2探针分子中GC％的影响
3杂交液中甲酰胺浓度的影响
4探针分子长度的影响
5与目标DNA错配的影响
6杂交液pH值的影响
（五）杂交的步骤
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验十一 显色法检测杂交结果
一 实验目的
二 实验原理
（一）酶法显色原理
1辣根过氧化物酶
2碱性磷酸酯酶
（二）免疫法检测原理
（三）生物素－亲和素法检测原理
（四）其他检测法
1胶体金标记――银加强检测法
2时间分辨荧光检测法
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验十二 PCR法鉴定人的性别
一 实验目的
二 实验原理
（一）PCR的引物设计
1引物的长度
2引物的GC％含量
3引物的3′端起始碱基
4引物无回文对称结构
5引物自身不能配对
6两个引物的Tm值
7两个引物之间不能配对
（二）PCR的反应体系
1模板DNA
2引物
三 分光光度计的使用
四 电泳仪的使用
五 微量移液器的使用
六 凝胶摄影
七 酚的重蒸与饱和处理
八 RNA酶的使用与预处理
九 缓冲液作用原理与Tris・Cl的配制
十 菌种与DNA样品的保存
十一 器皿的清洗处理
十二 器皿和试剂的灭菌处理
十三 器皿的硅化处理
十四 大肠杆菌常用基因型
参考文献
· · · · · · (收起)