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出版者:Independent Pub Group

作者:Kamberova, Gerda

出品人:

页数:284

译者:

出版时间:

价格:44.95

装帧:Pap

isbn号码:9781933255071

丛书系列:

图书标签:

DNA microarray
Gene expression analysis
Bioinformatics
Image processing
Data analysis
Genomics
Molecular biology
Biotechnology
Statistical analysis
Computational biology

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具体描述

《分子生物学实验技术：从基础到前沿》本书导言：在生命科学飞速发展的今天，分子生物学作为其核心领域，其技术手段的创新与完善直接推动了对生命现象理解的深度与广度。《分子生物学实验技术：从基础到前沿》一书，旨在为广大学生、科研人员以及实验室技术人员提供一本全面、深入且极具实践指导意义的工具书。本书摒弃了对单一、特定高通量技术的过度聚焦，转而构建一个涵盖分子生物学核心技术谱系的知识体系，强调实验设计的逻辑性、操作的精确性以及结果的可靠性与可重复性。我们深信，扎实的基础技术是探索复杂生命问题的基石。第一部分：核酸操作的基石本部分聚焦于生命信息的载体——核酸（DNA与RNA）的提取、纯化与定量，这是后续所有分子生物学研究的先决条件。第一章：高质量核酸的获取与评估细胞与组织裂解：详细阐述了不同类型样本（如细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物组织、石蜡包埋组织等）的机械、化学及酶学裂解方法。重点对比了有机溶剂法（酚/氯仿）与基于硅胶柱（Spin Column）法的优劣，并讨论了防止核酸降解的关键步骤，如RNase的灭活策略。纯化与洗脱的优化：深入解析了盐析法、PEG沉淀法在特定应用场景下的选择。对于硅胶柱法，细致讲解了洗脱缓冲液的pH值、离子强度对核酸得率和纯度的影响。核酸质量与浓度评估：介绍并对比了分光光度法（NanoDrop原理）、荧光定量法（Qubit、PicoGreen）在评估浓度和纯度方面的适用性。强调A260/A280和A260/A230比值的生物学意义，以及琼脂糖凝胶电泳在初步判断完整性上的作用。第二章：电泳与分子分离的艺术琼脂糖凝胶电泳原理与实践：详细阐述了凝胶浓度对分子分离效率的影响，缓冲液的配制与导电性控制。针对超高分子量DNA的分离（如脉冲场电泳的基础考量），提供了操作建议。非变性与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：区分了非变性PAGE在分析蛋白质-核酸复合物时的应用，以及变性PAGE在精确分离短片段核酸（如siRNA、寡核苷酸）时的技术要求。讨论了TBE与TAE缓冲液的选择依据。第二章：核酸的修饰与检测限制性内切酶的应用：深入讲解了II型、III型限制酶的切割特性，强调了酶切反应温度、缓冲液匹配（尤其是甲基化敏感性）对切割效率的影响。提供了双酶切和多酶切的策略设计。 DNA/RNA连接技术：详细阐述了T4 DNA连接酶的反应动力学，包括粘性末端、平末端连接的效率差异。重点介绍了现代分子克隆中快速连接技术（如Gibson Assembly, TA Cloning）的原理和实验步骤，强调了连接效率优化中的关键因素（如载体与插入片段的摩尔比）。第二部分：信号扩增与定量——PCR技术群深度解析本部分将PCR技术提升至原理与高级应用层面，而非仅仅停留在“如何设置引物”。第三章：聚合酶链式反应（PCR）的精细调控引物设计与退火温度的精确计算：不仅介绍Tm值计算，更深入探讨了引物二聚体、发夹结构对扩增效率的抑制作用。提供了Primer-BLAST等工具的使用指南及结果解读。热启动技术与酶的优化：阐述了化学修饰热启动酶与抗体热启动酶的工作机制，解释了它们在减少非特异性扩增中的优势。讨论了不同DNA聚合酶（如Taq, Pfu, Phusion）的保真度与延伸速度的权衡。传统PCR的故障排除：系统梳理了无产物、拖尾、非特异性条带等常见问题的成因（如模板降解、Mg²⁺浓度不当、循环次数过多），并提供了针对性的优化方案。第四章：实时荧光定量PCR（qPCR）的定量艺术荧光检测原理：详细解析了基于DNA染料（如SYBR Green I）和基于探针（如TaqMan）的信号产生与采集机制，强调了荧光淬灭的重要性。标准曲线的建立与内参基因的选择：强调了绝对定量和相对定量的设计逻辑。讨论了多个候选内参基因（如GAPDH, β-Actin, 18S rRNA）在不同实验系统（如细胞处理、组织差异）中的稳定性验证（如GeNorm, NormFinder软件的应用基础）。高精度定量考量：讨论了溶解曲线分析（Melting Curve Analysis）在验证PCR特异性中的不可替代性，以及Ct值与扩增效率的交叉验证。第五章：逆转录与cDNA文库构建 RNA提取的特殊性：重点关注RNA的稳定性问题，强调了无RNase环境的重要性，并比较了基于酸性酚的TRIzol法与基于柱子的RNA纯化法在去除基因组DNA污染方面的差异。逆转录（RT）的效率决定：比较了随机引物、寡(dT)引物和基因特异性引物（GSP）在合成第一链cDNA时的适用范围，并讲解了逆转录酶的活性与终止现象。第三部分：蛋白质的表达、分离与鉴定本部分从基因翻译的产物——蛋白质入手，探讨其在生命活动中的角色。第六章：重组蛋白的生产与纯化宿主系统的选择：详细对比了大肠杆菌、酵母（毕赤酵母）、昆虫细胞（Sf9/Baculovirus）和哺乳动物细胞（HEK293/CHO）在表达复杂蛋白质时的优缺点，特别关注了糖基化和蛋白折叠的差异。融合标签策略：分析了GST、His-tag、MBP等常见标签对表达、溶解性和纯化的影响，以及标签的去除策略。层析分离技术原理：深入讲解了亲和层析（Affinity Chromatography，以IMAC为例）、离子交换层析（IEC）和分子筛层析（SEC）的基本原理，并提供了多步纯化方案的设计流程。第七章：蛋白质的电泳分离与分析 SDS-PAGE的优化：细致解析了丙烯酰胺/双丙烯酰胺的比例（即凝胶的孔径）对分离不同分子量蛋白质的影响。讨论了上样缓冲液中还原剂（DTT, $eta$-巯基乙醇）的选择。等电聚焦（IEF）与双向电泳（2D-PAGE）：阐述了IEF分离蛋白质的等电点（pI）原理，并简要介绍了2D-PAGE在蛋白质组学初步分析中的应用，强调了载胶条（IPG strip）的使用规范。第八章：蛋白质的免疫学检测技术 Western Blotting的标准化流程：从抗体制备（多克隆与单克隆的区别）、转膜效率（PVDF与NC膜的比较）到显色条件（ECL的灵敏度调控），提供了全流程的质量控制点。 ELISA技术的多样性：比较了间接ELISA、夹心ELISA和竞争性ELISA在定量不同类型抗原或抗体方面的优势与局限性。第四部分：细胞与组织水平的技术第九章：细胞培养与无菌操作规范细胞株的建立与维护：强调了细胞复苏、传代、冻存的标准化操作，以及培养基的成分（血清批次、添加剂）对细胞表型的影响。无菌技术与污染控制：详细列举了真菌、细菌和支原体污染的识别方法（特别是支原体检测的必要性），并提供了洁净区操作的SOPs。第十章：细胞生物学基础成像技术光学显微镜的应用：区分了明场、相差、微分干涉差（DIC）以及荧光显微镜在观察细胞形态、活细胞动态过程中的应用。免疫荧光（IF）与免疫组化（IHC）：重点讲解了固定剂（甲醛、多聚甲醛、冰丙酮）对不同抗原表位的影响，以及预处理（如热修复、酶消化）在增强信号中的作用。结语：本书的编写核心在于“知其所以然”，鼓励读者在掌握技术流程的同时，深入理解背后的生化原理。通过对这些基础和进阶技术的系统梳理与实践指导，期望读者能够构建起一套稳健的分子生物学实验思维框架，为未来在基因编辑、系统生物学或疾病机制研究中游刃有余地设计和执行实验奠定坚实基础。