MicroRNA Methods

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出版者:Academic Pr
作者:Rossi, John J. 编
出品人:
页数:304
译者:
出版时间:2007-9
价格:$ 224.87
装帧:HRD
isbn号码:9780123739179
丛书系列:
图书标签:
  • MicroRNA
  • RNA
  • Molecular Biology
  • Genomics
  • Biotechnology
  • Methods
  • Protocols
  • Bioinformatics
  • Gene Expression
  • Cancer Research
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具体描述

MicroRNAs (miRNA) are tiny bits of genetic material that were unknown nearly 10 years ago but now represent an exciting field of study in biology. Upon their discovery, researchers revealed for the first time a new mechanism by which microRNA can stop the function of messenger RNA (mRNA) by literally cutting it in half, interfering with the normal function of specific messenger RNAs in gene expression. This "expression" of genes that code for essential proteins is essentially what controls whether a cell turns into a liver, lung, or brain cell, for example. Understanding what activates this process or stops it is a key to understanding the biological process and builds a foundation for advances in medicine and other fields. This volume in "Methods in Enzymology" presents valuable methods for studying MicroRNA, with three sections covering identification of MicroRNAs and their targets; Micro RNA expression, maturation and functional analysis; and MicroRNAs and disease.

实用分子生物学技术:从基础到前沿的实践指南 本书特色: 本书是一本面向分子生物学研究人员、研究生以及相关领域技术人员的深度实践手册,聚焦于构建、验证和应用一系列核心分子生物学工具和技术。它旨在提供一个全面且深入的视角,涵盖从经典实验操作到最新技术平台部署的完整流程,强调实验设计的严谨性、数据解读的准确性以及结果的可重复性。本书的重点在于“如何做”以及“为什么这样做”,而非仅仅停留在理论概述。 --- 第一部分:核酸操作与纯化的高级策略 第一章:高通量基因组DNA提取与质量控制 本章详细阐述了从不同生物材料(包括动植物组织、微生物菌株、石蜡包埋组织等)中高效提取高质量基因组DNA的优化方法。重点探讨了裂解缓冲液的配方调整以应对复杂的基质成分,以及酚氯仿萃取的替代方案(如基于固相萃取的自动化流程)。讨论了DNA的定量技术,包括Nanodrop、Qubit的精确使用,以及电泳和毛细管电泳对高分子量DNA完整性的评估标准。特别强调了针对下游下一代测序(NGS)文库制备的DNA质量阈值要求和预处理步骤。 第二章:RNA分离的挑战与解决方案 RNA的稳定性极易受RNase降解影响,本章深入剖析了从活体组织、细胞培养物到福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本中获取无降解RNA的“冷链”技术要求。详细介绍了酸性胍盐-苯酚法(如TRIzol的优化使用)的步骤细节、关键控温点,以及商用RNA纯化试剂盒的适用性评估。本章还涵盖了特定亚型RNA(如长链非编码RNA、环状RNA)的富集与分离技术,以及如何通过生物信息学工具初步评估RNA的质量和可测序性。 第三章:高效质粒构建与DNA/RNA修饰 本部分聚焦于分子克隆的现代实践。内容包括限制性内切酶消化的精确控制(酶量、缓冲液选择与时间优化)、连接反应的高效化(如T4 DNA连接酶的活性测试与转化效率的提升)。详细介绍了Gibson Assembly、Golden Gate Assembly等无缝克隆技术的原理、操作流程及其在构建复杂多片段载体中的应用。此外,还阐述了核酸的尾部修饰技术,如Klenow填充、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的加尾反应,及其在标记和序列分析中的作用。 --- 第二部分:蛋白质表达、纯化与功能分析 第四章:原核与真核表达系统的优化选择 本章比较了在大肠杆菌(如BL21系列)、毕赤酵母和哺乳动物细胞(如HEK293T、CHO)中表达重组蛋白的优缺点。详细介绍了针对不同蛋白的表达载体选择策略,包括选择合适的启动子(如T7、CMV)、标签系统(His-tag, GST, MBP)及其对溶解度和正确折叠的影响。重点讨论了诱导时机的控制、温度梯度优化以及伴侣蛋白在提高复杂蛋白表达中的作用。 第五章:蛋白质纯化的多级策略 本章是关于蛋白质纯化的实践蓝本。首先讲解了亲和层析(Affinity Chromatography)的基线优化,包括洗脱缓冲液的pH、盐浓度和洗脱剂选择。随后深入探讨了中压层析(MPLC)的应用,特别是离子交换层析(IEX)和疏水作用层析(HIC)在去除杂蛋白和内毒素方面的策略。最后,详细介绍了尺寸排阻层析(SEC)在蛋白质精纯、聚集体去除以及维持生理活性状态下的应用流程。 第六章:蛋白质相互作用及活性检测 本章关注蛋白质的功能性研究。内容涵盖了Co-Immunoprecipitation (Co-IP) 实验的严格控制,以区分真实和假阳性相互作用,包括抗体孵育条件的优化和洗涤步骤的精细化。深入介绍了Surface Plasmon Resonance (SPR) 和Bio-Layer Interferometry (BLI) 在定量测量分子间结合动力学参数($K_D$, $k_{on}$, $k_{off}$)中的操作流程和数据拟合技巧。此外,还包括了酶活性测定(Coupled Assays, Substrate Analysis)的标准化方案。 --- 第三部分:基因调控与细胞生物学核心技术 第七章:转染与稳定细胞株的建立 本章详细对比了化学法(磷酸钙、脂质体)、物理法(电穿孔)在不同细胞系中的适用性和效率。重点在于转染效率的标准化评估(使用荧光报告基因),以及如何针对难转染细胞系(如原代细胞、免疫细胞)定制优化方案。讨论了如何设计筛选标记(如抗生素抗性基因)和使用流式细胞仪或荧光显微镜来鉴定并分离高表达的稳定细胞株。 第八章:传统与新兴的基因编辑技术 本章聚焦于CRISPR/Cas9 系统的应用。内容包括:靶向序列的设计原则、脱靶效应的预测与最小化策略。详细介绍了Cas9核酸酶的递送方式(质粒、mRNA、RNP复合物)及其效率比较。此外,还涵盖了基础的基因敲除(Knockout)验证流程,如T7 Endonuclease I Assay、插入/缺失突变(Indel)的Sanger测序分析,以及如何利用高深度测序进行低频突变检测。 第九章:免疫印迹(Western Blotting)的疑难解答 Western Blotting作为基础技术,其可重复性常受挑战。本章提供了一个全面的故障排除指南。涵盖了从样本制备(裂解液配方、蛋白定量)到电泳分离(SDS-PAGE的胶体配比优化)、转膜(PVDF vs. 尼龙膜的选择、电流控制)的全过程。特别强调了一抗/二抗孵育的最佳条件,以及化学发光检测的信号优化和线性范围的确定,以确保定量结果的可靠性。 --- 第四部分:数据整合与高级成像技术 第十章:基于高通量测序的数据处理基础 本章面向需要从原始测序数据中提取生物学意义的研究者。内容涵盖了从FASTQ文件到可分析数据(如VCF, BAM)的基本流程,包括序列比对(如使用BWA, Bowtie2)、变异检测与注释的常用软件流程。重点讲解了数据质量评估(FastQC)和标准化处理,为后续的差异表达或结构变异分析奠定基础。 第十一章:荧光显微成像与定量分析 本章探讨了荧光成像技术在细胞生物学中的应用。详细介绍了免疫荧光(IF)和荧光原位杂交(FISH)的染色方案优化,包括样本固定、通透化的影响。深入讨论了共聚焦显微镜的使用原理,以及如何进行三维重建和荧光光谱的去卷积处理。最后,介绍了ImageJ及其插件在定量分析荧光强度、细胞形态学特征和空间定位(如FRET/BRET初步概念)方面的实用技巧。 第十二章:生物信息学工具箱与实验整合 本章旨在弥合湿实验与干实验之间的鸿沟。介绍了管理实验数据流(LIMS初步概念)、报告结果和进行统计分析的标准流程。涵盖了如何选择合适的统计检验方法(t检验、ANOVA、非参数检验)以及处理多组学数据的基本原则。强调了实验重复性(Biological vs. Technical Replicates)在数据可信度中的核心地位。 --- 本书总结: 《实用分子生物学技术:从基础到前沿的实践指南》不仅仅是一本实验手册,更是一个面向复杂分子生物学问题的解决框架。通过对每项核心技术的深度剖析、优化参数的讨论以及常见错误的规避,本书致力于提升研究人员的实验技能,确保科研成果的稳健性与高标准。

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从装帧和排版来看,这本书散发着一种强烈的、不加修饰的学术气息,这本该是严谨的标志,但在实际阅读体验上却成了一种负担。纸张的选择偏向于哑光,虽然减少了反光,但墨迹的清晰度在某些复杂的图表和流程图中表现得并不理想。更令人费解的是,图注和正文的交叉引用常常显得混乱,很多关键的示意图甚至没有清晰的标注来对应文本中描述的特定试剂或步骤。我常常需要在不同的章节之间来回翻阅,试图拼凑出一个完整的实验场景。这不仅仅是阅读上的不便,更可能在实际操作中导致耗费时间甚至实验失败。这本书似乎更侧重于内容本身的堆砌,而对读者如何高效、舒适地吸收这些信息考虑不足。它更像是一份打印出来的会议摘要集,而不是一本精心编排、旨在帮助学习的工具书。我希望未来的版本能在这方面有所改进,毕竟,好的方法论也需要好的呈现方式来支撑。

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这本书的术语密度高到令人发指,感觉作者在撰写时,默认读者已经对所有相关领域的缩写了如指掌。每一个段落都充斥着各种专业缩写,比如miRNA、siRNA、lncRNA、qPCR、NGS,以及各种特定的酶和试剂盒的代号。尽管书的开头可能有一个简短的缩写列表,但在实际阅读中,频繁地停下来查阅这些缩写,极大地打断了思维的连贯性。这不仅仅是阅读体验的问题,更重要的是,它限制了这本书的受众范围。如果这本书的目标是成为一个通用的参考指南,那么它应该以更平易近人的方式来组织信息。这种过度依赖行话的做法,使得任何一个非特定领域出身的科研工作者,想要快速从中获取有效信息,都必须付出额外的认知努力,让人感觉作者似乎更在意展示自己知识的广度和深度,而非真正有效地传授知识。

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这本关于微小核糖核酸研究方法的书,实在是让我这个初入分子生物学领域的学生感到有些力不从心。从拿到这本书开始,我就被那密密麻麻的实验流程和晦涩难懂的专业术语所包围。书中的内容仿佛直接跳过了基础概念,直奔复杂的实验操作细节,让我这个连微小核糖核酸的基本作用机制都还没完全理清的人,读起来像是在攀登一座陡峭的山峰,每向上一步都得气喘吁吁,生怕走错一个环节就会前功尽弃。尤其是关于高通量测序数据的分析部分,那复杂的生物信息学流程描述,简直是对我耐心和理解力的双重考验。我花了大量时间去查阅各种背景知识,试图将书中的每一个步骤与我已知的分子生物学知识联系起来,但收效甚微。整本书的结构更像是一本给资深研究人员准备的“操作手册”,而非一本能引导新手逐步学习的“教科书”。对于那些希望系统了解微小核糖核酸研究全貌的人来说,这本书可能过于技术化,缺乏必要的导引性,让人在实操层面摸不着头脑,在理论层面又感到空泛。

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我不得不承认,这本书在汇集现有技术方面确实做到了包罗万象,几乎涵盖了从微小核糖核酸的提取、鉴定到功能验证的每一个关键环节。然而,这种“全”反而带来了一种令人窒息的密度感。作者似乎将所有已知的“方法”一股脑地塞进了这本不算太厚的册子里,没有给予任何一种方法足够的空间去细致阐述其背后的科学原理和潜在的局限性。例如,在描述几种不同的荧光原位杂交技术时,书中只是简单地罗列了每种方法的步骤,却鲜有对比性的分析,比如哪种更适合组织切片,哪种对RNA丰度要求更高。这种蜻蜓点水的叙述方式,使得读者很难根据自己的研究需求做出明智的选择。每次我试图深入探究某一特定实验的“诀窍”时,书中总是戛然而止,留下的只有一串待解的疑问。对于我们这些需要将知识转化为实际实验设计的人来说,缺乏这种深入的、批判性的方法论探讨,无疑削弱了本书的实用价值。

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我是一个偏爱从历史脉络和概念发展角度理解技术的科研人员。因此,我对这本书中那种“当前最佳实践”的论述方式感到略微失望。书中对于每种方法的描述,都是以一种“现在就这样做”的口吻呈现的,仿佛这些技术是凭空出现的,完美无缺。我非常期待能看到一些关于这些方法是如何一步步演进的讨论,比如早期的限制性技术遇到了什么瓶颈,才促使研究人员开发出如今的这些改进版方法。缺乏这样的背景故事和技术演进的批判性回顾,使得这些方法显得有些僵化和刻板。读者无法从中体会到科学探索的曲折和智慧,也就难以在遇到问题时灵活变通。这本书更像是一份静态的技术快照,而不是一个充满生命力的动态知识体系,这对于培养科研人员的创新思维是极其不利的。

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